1、ハイドロゲルモノマーの組織への浸潤

CLARITY法では、前処理として、組織内部のタンパク質や核酸分布の保持のためにアクリルアミドベースのハイドロゲル溶液を使用します。

ハイドロゲルモノマー溶液4%PFA, 4%アクリルアミド,0.25% VA-044(重合開始剤,Wako)

上記の溶液を動物の灌流固定の際に使用します。組織内部のタンパク質をアクリルアミドとPFAとで共有結合します(Fig. 1)。PFAがタンパク質とアクリルアミドをアルデヒド結合で架橋します。



Fig. 1 組織のハイドロゲルの浸潤と化学結合



2、アクリルアミドベースによる組織内部のタンパク質固定

ハイドロゲルモノマー溶液に漬け込んだ組織の温度を37℃まで上昇させて組織内部のタンパク質等を固定するために重合させます。これによってアクリルアミド重合によって形成された網目構造にタンパク質が強固に固定されます(Fig. 2)。通常のホルマリン固定と比べ、タンパク質が強く保持されているため、後の分子ラベリング技術へ応用できます。



Fig. 2 ハイドロゲル重合による組織内部のタンパク質固定



3、SDS-PAGEを利用する組織透明化

ハイドロゲルモノマー溶液を使用して固定化させた組織(ゲル化組織)をSDS-PAGEの原理を利用して脱脂を行ないます。通常、SDS-PAGEであればタンパク質等も移動してしまいますが、ゲル化によってタンパク質は保持され、SDSのミセルによって細胞膜や脂肪由来の脂質だけが洗浄されます(Fig. 3)。脂肪成分が除去された組織は本来の色味を失い、透明な組織へ生まれ変わります。さらに組織の屈折率に合わせた高屈折率試薬に浸潤させれば、より透明度の高いクリアな組織が完成します。



Fig. 3 SDSミセルによる組織の脂質洗浄


作成日 2017/06/25

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