マウス全脳でcFos染色に成功しました！ | BRC バイオリサーチセンター商品情報

マウス全脳でcFos染色に成功しました！

SmartLabel高速免疫染色システムの技術紹介がぶんせき誌4月号に掲載されました。組織透明化手法 CLARITYとは

マウス全脳でcFos染色に成功しました！

c-Fos抗体を導入したマウス全脳の海馬および大脳皮質

c-Fosの発現は、直近の神経細胞の活動の指標であり、c-Fos陽性の細胞の検出は多くの神経科学者にとって優先度の高い課題となっています。この動画は、抗c-Fos抗体で染色したマウス全脳の海馬と大脳皮質を横断面で捉えたものです。このデータは、LifeCanvas社のライトシート顕微鏡SmartSPIMを用いて、倍率3.6X, 4 µmのZスタックで取得しました。c-Fosの染色は、高速免疫染色システムであるSmartLabelで行なっております。

このような膨大なデータの定量化において、LifeCanvas社は大規模な3Dデータセット用に設計された機械学習解析システムである「SmartAnalytics」を開発しました。

〇SmartAnalyticsでできること

アトラス画像の整理
細胞検出
蛍光強度の定量化

左：抗c-Fos抗体で染色したマウス脳半球の領域別の細胞密度のヒートマップ、右：同サンプルのヒストグラム (SmartAnalyticsで作成)

作成日 2021/06/07

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組織透明化手法 CLARITYとは

アクリルアミドベースのハイドロゲルを使い組織を透明化する技術です。CLARITYは脳や臓器などの組織を丸ごと透明なハイブリッドゲルに変換することで可視光および蛍光マーカーのアクセスを向上します。

CLARITY法のメカニズム

CLARITY法では、前処理として、組織内部のタンパク質や核酸分布の保持のためにアクリルアミドベースのハイドロゲル溶液を使用します。

組織透明化とは、、、

組織全体を透明化する技術の開発は、組織観察の常識を超える技術の発明でした。理化学研究所のグループが樹立したSca/e（1）やウイーン大学が発明した3DISCO（2）は世の中に透明化試薬を知らしめるきっかけとなった報告例です。マウス全脳の組織を特定の試薬に浸け込むことで丸ごと透明化し、組織全体の蛍光イメージングを成功させた事例は神経科学分野に鮮烈な印象を与えました。

CLARITY透明化にかかる日数

前染色した組織の場合は、透明化処理をして高屈折率試薬に組織を浸漬させるだけのシンプルな工程です。組織透明化までおよそ4日程度です。

CLARITYの特長

CLARITY法は何といっても透明化速度が速いのが特長です。SDS-PAGEの原理を利用して脱脂を強力に行なうことで短時間での透明化を実現できます。透明化の速度は、温度条件、電流値に大きく左右されます。これらのパラメータを適切に組織ごとに選択する必要があります。

CLARITY透明化手法の心配なところ

SDS電気泳動では経時変化によって、SDSバッファーのpHが低下していきます(Fig. 1)。これは電極間の電気化学反応によって、pHが酸性側に傾くためです。そのため、組織内部のタンパク質の変性に影響する可能性が示唆されています。

透明化組織の新しい染色アプローチ

組織の染色には数10 µmの厚さにスライスした切片を用いることが一般的です。これは染色に使用する抗体が組織深部へアクセスすることが困難なため、薄くスライスした切片標本が必要になります。そのため、顕微鏡で撮像する際は染色した切片画像をつなぎ合わせる作業が必要です。透明化標本の場合、特にCLARITYなどの脱脂を伴う方法で作成したサンプルは、スライスをせず全組織のまま抗体を深部までアクセスすることが可能になりますが、通常の浸漬法では抗体を深部まで染めるのに数週間ほどかかります。この時間を短縮するために、電気泳動法を用いて抗体を物理的な拡散で組織深部へ移動させる方法が開発され(1)、同年にCell誌で全組織を抗体染色する新しいアプローチとして、「Switch」法が発表されました。このSwitch法は、抗体をラベリングする際にOFFとONの2つの溶液を使用することがポイントです。 OFF溶液：低pHかつSDSを含む ON溶液：中pHでSDSを含まない OFF溶液は低pHかつSDSを含む溶液に調製されており、抗体が組織へアクセスしても標的抗原には結合しません。このOFFステップで組織内へ均一に抗体を分布させた後、ON溶液に切り替えることで組織内へ浸潤した抗体が抗原と結合します。この2つのステップを介することで、抗体の染色ムラを抑え、均一なラベリングを行なうことができます。このSwitch法と電気泳動の高速免染を掛け合わせたのが、SmartLabel高速免疫染色システムになります。

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SHIELD タンパク質のロスを抑制した新しい組織固定

SHIELDは、組織内の核酸やタンパク質のロスを抑制した新しい組織固定方法です。

電気泳動を利用する組織抗体染色法

eFLASHは電気泳動技術を利用して組織全体の均一性を考慮した高速免疫染色法です。

ライトシート顕微鏡　SmartSPIM

サンプルのイメージを面で捉えることができるライトシート顕微鏡は、組織透明化研究において強力な解析ツールとして作用します。共焦点や2光子顕微鏡と言えど、全組織をスキャニングして撮像するにはかなりの時間を要します。一方、ライトシート顕微鏡はシート状の励起光を利用することでサンプルの断面からの蛍光を検出することができるため、短時間でのホールイメージングが可能になります。

SmartLabel高速免疫染色システムの技術紹介がぶんせき誌4月号に掲載されました。

LifeCanvas Technologies社SmartLabel高速免疫染色システムが、日本分析化学会が編集を務める「ぶんせき誌」の4月号に掲載されました。

マウス全脳でcFos染色に成功しました！

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